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細(xì)胞復(fù)蘇凍存注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2018-08-22      點(diǎn)擊次數(shù):1682
  細(xì)胞復(fù)蘇凍存注意事項(xiàng)
  凍存和復(fù)蘇的原則:慢凍快融
  當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
  如果緩慢冷凍,可使細(xì)胞逐步脫水,細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反,結(jié)晶就大,大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結(jié)晶。
  慢凍程序
  1.  標(biāo)準(zhǔn)程序:采用細(xì)胞凍存器
  當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí),  1~2 ℃/min;
  當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí), 5~10 ℃/min;
  當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí),可迅速放入液氮中。
  2.  簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜,次晨投人液氮中。
  3.  傳統(tǒng)程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。
  細(xì)胞凍存方法
  1.  預(yù)先配制凍存液
 ?。?)10%DMSO + 細(xì)胞生長液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)
  2.  取對數(shù)生長期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml)。
  3.  加入1 ml細(xì)胞于凍存管中,密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。
  保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
  1.  快速解凍
  凍存細(xì)胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動(dòng)冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。
  2.  解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng),24小時(shí)后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO。
  3.  如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
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